研究背景

急性肾损伤是一种高发病率、高死亡率的临床综合征，缺血再灌注是其常见原因。其损伤机制并非单一因素所致，而是涉及氧化应激、线粒体损伤、mtDNA释放、STING通路激活以及巨噬细胞-肾小管交互放大炎症等多个环节相互耦合、彼此强化。现有纳米疗法多聚焦于单一机制，例如单纯清除活性氧或递送抗炎货物，对免疫微环境重塑的关注相对不足，难以打断氧化应激与天然免疫之间的恶性循环。基于这一背景，构建一个能够同时干预多个关键节点的协同治疗平台，成为突破现有疗法局限的重要方向。

研究通过逐步静电组装策略成功构建了D4F功能化脂质纳米颗粒，粒径约215–245 nm，PDI约0.22–0.25，表面电荷符合预期。电子自旋共振、ABTS、DPPH和溶氧实验证实，制剂化后CeO₂仍保留自由基清除活性，并具备类过氧化氢酶活性。在PBS或含10%胎牛血清的DMEM中，4°C和37°C条件下7天内粒径未出现突增，理化稳定性良好，细胞相容性和溶血实验也显示工作浓度范围内安全性可接受。这些结果为后续细胞和体内实验提供了基础。

在RAW264.7巨噬细胞中，D4F功能化显著提高了绿色荧光蛋白的递送效率，阳性细胞比例达到48.2%，明显优于未功能化和单功能制剂。在脂多糖刺激条件下，含CasRx的制剂降低了STING总蛋白丰度，其中D4F功能化组降幅最大；磷酸化STING与总STING的比值无显著变化，但磷酸化TBK1与总TBK1、磷酸化IRF3与总IRF3的比值呈渐进性下降，表明治疗效应源于STING丰度降低，而非下游蛋白被全面抑制。通过第二条独立的STING靶向向导RNA以及抗向导RNA识别的回补构建体，研究验证了序列特异性。同时，D4F功能化制剂将脂多糖诱导的活性氧阳性细胞比例从71.9%降至24.5%，显著优于单功能制剂和未功能化双功能制剂。巨噬细胞表型也发生转变，CD86阳性（M1样）比例下降，CD206阳性（M2样）比例上升，肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、趋化因子CCL5、转化生长因子β降低，白细胞介素10升高，支持巨噬细胞向抗炎促修复状态转变。

条件培养基转移实验进一步验证了巨噬细胞表型改变的功能意义。将处理后的巨噬细胞分泌组转移到缺氧损伤的TCMK-1肾小管上皮细胞后，来自D4F-CeO₂@LNP-CasRx(STING)处理巨噬细胞的条件培养基显著降低了受体细胞的凋亡比例和ROS积累，提高了GSH/GSSG比值、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性，并降低了Tnf、Il1b和Il6的表达。由于受体细胞并未直接接触纳米颗粒，这些结果明确表明，巨噬细胞分泌组的重编程是肾小管保护效应的重要中介环节。

在外周血单个核细胞（PBMC）偶联的肾脏类器官中，D4F功能化提高了纳米平台在缺氧组织中的积累，FITC阳性率从9.65%升至27.5%，光学切片显示其在10–50微米深度处的荧光信号更强。同时，D4F功能化增加了CD4⁺FOXP3⁺ Treg频率，从约9%升至14%。在损伤读出方面，D4F-CeO₂@LNP-CasRx(STING)组表现出最高的类器官活力、最弱的γH2AX信号和最低的HAVCR1表达，表明该平台在更复杂的组织环境中仍能提供保护和修复支持。

全身成像显示，D4F功能化制剂在1至48小时内肾脏区域荧光更强、更持久，离体器官成像和器官特异性时间曲线进一步证实了肾脏的持续增强蓄积。肾脏切片共染显示，D4F功能化增加了Cy5.5荧光与F4/80⁺巨噬细胞的空间重叠，外周血中F4/80⁺细胞表现出最强的Cy5.5信号，表明增强的肾脏蓄积与巨噬细胞相关分布模式密切相关。在安全性方面，健康小鼠接受两次间隔3小时的静脉注射后，45天主要器官组织学检查未见明显异常，血液学和生化指标与生理盐水组相当，支持该给药方案下良好的体内耐受性。

在小鼠肾缺血再灌注模型中，D4F-CeO₂@LNP-CasRx(STING)显著改善了肾功能，降低了血尿素氮和血清肌酐，并减轻了肾小管损伤评分。DHE荧光显示治疗组肾脏ROS水平降低，CD11b⁺巨噬细胞中STING信号及下游TBK1、IRF3磷酸化受到抑制，全肾NLRP3、IL-1β和KIM-1水平也下降。离体培养的肾脏巨噬细胞显示，治疗组分泌更少TNF-α和IL-6、更多IL-10，与抗炎促修复表型一致。PAS染色和两个月后的Masson染色分别支持急性期肾小管形态保留和长期间质胶原沉积减少。

空间转录组学显示，治疗组肾脏从炎症/M1主导的免疫微环境转向修复/M2和Treg富集的状态，近端小管不再紧密相邻于炎症性巨噬细胞富集区，而是嵌入更平衡的免疫微环境。STING/IFN、NF-κB和炎症小体相关基因表达受到抑制，修复相关巨噬细胞标志物如Mrcl、Cd163、Msr1相对富集。蛋白质组学从正交层面验证了这些发现，治疗相关蛋白富集于活性氧解毒、过氧化物酶体代谢、FOXO介导的转录、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢和线粒体生物发生，而AKI相关蛋白与NF-κB激活、TNF信号、凋亡、胞质DNA感知和衰老相关分泌表型相关。STING/DNA感知模块和NF-κB通路组分在治疗肾脏中广泛减弱，抗氧化和修复相关蛋白如Sod2、Cat、Gpx1、Arg1、Mrcl升高。

该研究提出了一种“氧化还原调控 + RNA水平STING沉默 + 巨噬细胞靶向递送”的协同治疗策略，在细胞、类器官和动物模型中均表现出对AKI的保护作用，并重塑了肾脏免疫微环境。空间转录组和蛋白质组分析进一步将这些效应与炎症损伤程序收缩以及抗氧化、代谢和修复相关网络恢复联系起来。作者认为，这种RNA递送纳米酶平台有望为AKI治疗提供新的思路，但延迟治疗、长期铈清除、质粒持久性、免疫原性等问题仍需进一步研究，剂量-反应关系、药代动力学以及AKI向CKD转化的定量结局也有待明确。