引言

常染色体显性多囊肾病（ADPKD）是终末期肾病的常见遗传病因，约10%的病例由其进展而来，其中85%源于PKD1杂合突变。cAMP通路驱动囊肿进展，但早期事件尚不清楚，也缺乏能准确反映杂合突变背景的药物研究模型。现有模型各有局限：动物模型存在种属差异，患者细胞系易受环境影响，人胚胎干细胞类器官也未能证实杂合突变可重现囊肿表型。因此，亟需建立遗传精准的ADPKD类器官模型，用于药物筛选与机制研究。

为此，日本京都大学iPS细胞研究与应用中心（CiRA）的Kenji Osafune团队在题为“A novel ADPKD model using kidney organoids derived from disease-specific human iPSCs”的研究中，通过构建PKD1基因编辑及患者来源的hiPSC肾脏类器官，系统验证了囊肿形成的遗传基础与药物反应，为此类模型的可行性与应用价值提供了关键证据。

首先，研究成功构建了PKD1基因编辑的hiPSC系作为肾脏类器官ADPKD模型基础。研究人员针对PKD1基因外显子34的剪接受体位点设计sgRNA，该编辑可导致移码突变和提前终止密码子，使PKD1蛋白截短失活，同时避免前33个外显子中6个高度相似假基因的脱靶风险。Sanger测序证实成功获得了野生型（WT）、PKD1杂合突变（PKD1+/-） 和 PKD1纯合突变型（PKD1-/-） 三种基因型的hiPSC系，cDNA测序进一步确认突变导致移码并产生提前终止密码子，预测蛋白被截短。随后将三种基因型hiPSC分化为肾脏类器官，至第10天时三者均形成致密、结构完整的球状类器官且外观无差异；免疫荧光染色显示足细胞（PODXL）、近端小管（LTL）和远端小管（CDH1）分段结构在三种基因型中均正常存在且分布模式相似，证明PKD1突变不影响类器官分化能力，为后续囊肿诱导实验奠定了基础。（图1）

图1. PKD1突变型hiPSC系的建立及其向肾脏类器官的分化

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在肾脏类器官ADPKD类器官模型验证阶段，研究发现毛喉素（Forskolin）能诱导PKD1突变型类器官形成囊肿，且纯合突变型囊肿最为严重、杂合突变型次之、野生型极少，充分体现了PKD1突变在囊肿形成中的关键作用。经毛喉素处理7天后，野生型类器官几乎无囊肿，杂合突变型出现明显囊肿，纯合突变型则形成更大、更多的囊肿；定量分析证实三种基因型之间的囊肿面积占比差异具有统计学意义（p < 0.005和p < 0.001）。免疫荧光染色显示囊肿主要起源于近端小管（LTL⁺），少数为远端小管（CDH1⁺），肾小球区域未受累及，且部分LTL阳性囊肿染色减弱提示上皮细胞去分化。（图2）

图2. 毛喉素（Forskolin）诱导人肾脏类器官形成囊肿表型

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研究进一步用ADPKD患者来源的hiPSC验证了模型的可重复性。患者来源的hiPSC成功分化为结构完整的肾脏类器官，且三种分段结构均正常存在。经毛喉素处理7天后，两位患者来源的类器官内部均出现大量透亮囊肿，而两个对照组几乎无囊肿；定量分析显示患者组囊肿面积显著大于对照组（p < 0.001）。免疫荧光染色显示囊肿主要起源于近端小管（LTL⁺），少数起源于远端小管（CDH1⁺），与基因编辑模型的表型高度一致，证实患者来源肾脏类器官模型能重现囊肿形成。（图3）

图3. ADPKD患者来源的肾脏类器官重现囊肿形成

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最后，研究验证了肾脏类器官ADPKD模型模型作为药物筛选平台的可行性。在毛喉素存在下用不同药物处理患者来源类器官7天，结果显示：托伐普坦（Tolvaptan）处理组囊肿仍大量存在，与阳性对照组无显著差异，与毛喉素直接激活cAMP、绕过V2R受体的机制一致；而CFTR抑制剂172和依维莫司（mTOR抑制剂）处理组囊肿均明显减少，定量分析显示囊肿面积分别显著减少（*p < 0.05和**p < 0.005），验证了CFTR和mTOR信号通路在囊肿发生中的重要作用。组织学检查显示毛喉素处理1小时后肾小管即明显扩张，而加入CFTR抑制剂172后扩张被显著抑制，证明该抑制剂作用于囊肿形成的早期阶段，通过阻断CFTR介导的液体分泌来抑制囊肿起始。（图4）

图4. 肾脏类器官是鉴定ADPKD新治疗靶点的潜在筛选平台

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该研究从基因编辑模型构建出发，经表型验证和患者来源模型确认，最终建立了一套完整的ADPKD肾脏类器官体系。该ADPKD肾脏类器官模型不仅证实了杂合突变背景下的囊肿形成能力，还成功验证了已知药物反应的预测效度，为ADPKD的早期机制探索和药物筛选提供了可靠的体外平台，也为其他遗传性肾病类器官模型的构建提供了可借鉴的研究范式。