图1d（点击图片可放大）

• 肾脏谱系图以中间中胚层（IM，intermediate mesoderm）为起点，分为前部中间中胚层（Anterior IM）和后部中间中胚层（Posterior IM）。

• 前部中间中胚层形成肾管（Nephric duct），随后通过起始（Initiation）形成输尿管芽（UB），输尿管芽经过分支（Branching）分为柄（Stalk）和尖（Tip），最终与远端小管（Distal tubule）发生身份趋同与融合（Convergent identity and fusion）。

• 后部中间中胚层形成后肾间充质（Metanephric mesenchyme），进而分化为肾单位祖细胞（NP）和间质祖细胞（SP）。

• 肾单位祖细胞经过凝聚（Condensation）形成前小管聚集（Pretubular aggregate），随后通过间充质-上皮转化（MET，mesenchymal-to-epithelial transition）形成肾小囊（Renal vesicle），再经过极化（Polarization）、分段（Segmentation）形成逗号/S型小体（Comma-/S shaped body），最终分化为远端小管（Distal tubule）、髓袢（Loop of Henle）、近端小管（Proximal tubule）、足细胞（Podocyte）和肾小球（Glomerulus）。

• 间质祖细胞一部分分化为系膜细胞（Mesangial cells）参与肾小球构成，另一部分分化为其他支持细胞（Other supportive cells）。

图1a （1）（点击图片可放大）

• 小鼠胚胎肾脏发育过程中，输尿管芽（UB）发生分支形态发生（Branching morphogenesis），并伴随迁移性肾单位祖细胞生态位（Traveling NP niches），图中标注了E11、E12和E15三个胚胎发育时间点。

图1a （2）（点击图片可放大）

• 肾源性生态位（Nephrogenic niche）由间质（Stroma）、肾单位祖细胞（NP）和输尿管芽（UB）构成，三者通过FAT4、DCHS1/DCHS2、维甲酸（Retinoic acid）、Wnt9b、GDNF和RET等信号通路相互调控，其中肾单位祖细胞将形成未来的肾单位（Future nephron）。

• 肾单位发育从肾单位祖细胞开始，依次经历前小管聚集（Pretubular aggregate）过程中的凝聚（Condensation）、肾小囊（Renal vesicle）阶段的极化（Polarization）并伴随间充质-上皮转化（Mesenchymal-to-epithelial transition）、逗号小体（Comma-shaped body）阶段的进一步分段（Further segmentation）、S型小体（S-shaped body），最终形成毛细血管襻期肾单位（Capillary loop stage nephron）。

图1c（点击图片可放大）

• 自我相似分支与肾单位形成过程通过在每个生态位创建新的位点（New site），实现多轮肾单位形成，这一机制体现了集合管与肾单位的并行化（Parallelization of collecting tubules and nephrons）以及自我相似的肾发生过程（Self-similar nephrogenesis）。

• 随着时间推移（Time），依次形成肾单位1（Nephron 1）、肾单位2（Nephron 2）和肾单位3（Nephron 3），并呈现出皮髓质分区（Corticomedullary zonation），包括肾源性区（Nephrogenic zone）、皮质（Cortex）和髓质（Medulla）。

图1b（点击图片可放大）

图1e（点击图片可放大）

• 针对肾脏各主要谱系已发表的类器官模型汇总

图2a（点击图片可放大）

• 形态发生环路（Morphogenesis loop）呈现了发育基序（Developmental motif）中四个关键要素的循环调控逻辑：自我组织（Self-organization）（包含对称性破缺）驱动形态建成（Morphology）（包含分支、极化、融合），形态建成受细胞输入（Cell inputs）（包含细胞间相互作用、基质、生化梯度、基因表达）调控，细胞输入进而决定细胞的谱系与生物物理特性（Lineage and biophysical properties）（由细胞间粘附和皮层张力共同决定谱系特化），而谱系与生物物理特性最终又反馈调节自我组织，从而形成闭环。

图2b （点击图片可放大）

• 发育工程学策略（Developmental engineering strategy）的核心在于将体外组织的初始条件靶向设定在临界点（Critical point/initial condition for engineering），利用目标基序内的自我组织来构建结构。

• 以肾脏发育为例，沿发育时间（Developmental time）顺序发生多个连续基序（Sequential motifs），包括基序1（Motif 1）、基序2（Motif 2）和基序3（Motif 3），分别对应输尿管芽（UB）、肾单位祖细胞（NP cells）和肾单位（Nephrons）的形成过程。

图2c（点击图片可放大）

•  “菊花链”策略（Daisy chain strategy）通过直接组装将不同发育基序构建的结构组合起来。

• 基序不必按顺序发生（Nonsequential motifs），例如可直接从基序1连接至基序3（1→3）。组装方式包括pDPAC（光刻DNA编程细胞组装技术）、生物打印（bioprinting）等。

• 通过这种非顺序性组装，可以构建高阶功能性组织结构（higher-order functional tissue structures），这些结构不一定与体内组织方式完全相同。

• 在规模放大（Scale-up）过程中，可采用多个基序1与基序3的组合（1→1→1→3）进行逐步整合，后续步骤可涉及生物反应器（Bioreactor）培养，例如将肾单位祖细胞球（NP spheroids）作为组件进行组装。

图3b（点击图片可放大）

• 通过嵌合体干细胞来源类器官中的初始细胞比例（initial cell ratio），可以实现对谱系组成和肾单位分段（Controlled lineage composition and nephron segmentation）的调控。

• 利用DNA编程的细胞组装（DNA-programmed assembly of cells）技术，精确控制输尿管芽（UB）和肾单位祖细胞（NP）的接种比例（Seeding ratio），进而影响类器官大小（Organoid size）、谱系比例（Lineage ratio）以及肾单位节段比例（Nephron segment ratio），包括远端（Distal）和近端（Proximal）分段。

图3c（点击图片可放大）

• 在生物打印（Bioprinting）过程中，通过打印喷嘴（Nozzle）挤出细胞糊剂（Printed cell paste）进行图案化。

• 尽管预设了预期的打印结果（Intended outcome），但由于细胞内在的自组织长度尺度（Length scale set by self-organization）的调控，实际结果（Actual outcome）会覆盖预设的图案化长度尺度，导致最终形成的结构不同于原始设计。

图3d（点击图片可放大）

•  “动态形态”方法（Kinomorph approach）用于匹配组织尺度的生物打印与自组织长度尺度。

• 该混合方法（Hybrid approach）首先在二维基底上，通过细胞结合和基底结合的单链DNA（ssDNA）之间的“魔术贴”样碱基配对创建细胞图案，其中脂质单链DNA（Lipid ssDNA）参与介导，基底上设有单链DNA微图案（ssDNA micropattern）。

• 在这一过程中，以绿色线条标注MDCK细胞（MDCKs），以红色线条标注成纤维细胞（Fibroblasts）。

• 细胞图案形成后（尺度约0.5 mm），被嵌入细胞外基质凝胶中（Embed in ECM）。

• 随后，在细胞驱动的全局应变（Global strain）作用下，系统发生自组织，最终扩增形成顶底极化的肾小管网络（Tubule network），尺度可达1厘米（Scale-up 1 cm）。

图4a（点击图片可放大）

• 输尿管芽尖端局部存在肾单位祖细胞的“传送带”生态位结构（Conveyor belt niche structure）。

• 当肾单位祖细胞（NP）从皮质区向髓质区肾源性区迁移时，其细胞张力与细胞间粘附（Adhesion/tension）逐渐增加，如同“能量棘轮”（energetic ratchet）般推动其进入分化状态，形成前小管聚集（PTA）。

• 调控肾单位祖细胞分化（Differentiation）与自我更新（Renewal）平衡的关键信号通路包括Wnt–β-catenin、FGF–EGF–MAPK、Notch、Hippo、P13K–AKT、JAK–STAT和TGFβ–BMP。

图4b（点击图片可放大）

• 通过SynNotch及相关技术，可以实现对分化和细胞间粘附进行远程控制的细胞工程（Cell engineering for remote control over differentiation and cell–cell adhesion via SynNotch and related techniques）。

• 这些细胞工程工具（Cell engineering tools）可应用于肾单位祖细胞（NP），通过调控差异基因表达（Differential gene expression）和差异钙粘蛋白表达（Differential cadherin expression），进而影响分化（Differentiation）和细胞分选（Cell sorting）行为。

图4c（点击图片可放大）

• 肾单位极性与分段（Nephron polarity and segmentation）的调控机制体现在体内和体外两种情境中。

• 在体内（In vivo），沿早期肾单位存在的Wnt–β-catenin（Wnt–β-cat.）梯度诱导分段形成，分别产生远端小管（Distal tubule）、中间小管（Medial tubule）和近端小管（Proximal tubule）。

• 在体外（In vitro），通过构建分泌Wnt的工程细胞团即合成组织者（Synthetic organizer），可以诱导邻近肾单位谱系细胞产生肾单位方向性与分段（nephron directionality and segmentation）。

• 强组织者（Strong organizer）和弱组织者（Weak organizer）对远端–近端（Distal proximal）分化的影响也存在差异。

图4d（点击图片可放大）

• 水凝胶中应力松弛工程（stress relaxation engineering in hydrogels）对肾单位形态与定位的影响可通过力学微环境控制（Mechanical microenvironment control）来阐释。

• 以应力（Stress）为纵坐标、时间（Time）为横坐标，在恒定形变（Constant deformation）条件下，慢松弛（Slow relaxing）与快松弛（Fast relaxing）水凝胶的应力衰减曲线呈现明显差异。

• 不同水凝胶力学特性对肾单位类器官（Nephron organoid）形态的影响体现在分段情况（Segmentation）、迂曲度（tortuosity）和空间分布（spatial distribution）等方面。

图4e（点击图片可放大）

• RET活性对输尿管芽尖端细胞行为的调控体现在多个方面。

• GDNF–RET信号轴（GDNF–RET axis）驱动输尿管芽分支形态发生，其中GDNF作用于输尿管芽尖端（Tip）的RET，调控肾单位祖细胞归巢（Homing）、尖端细胞增殖（Proliferation）以及退出与分化（Exit, differentiation），而输尿管芽柄部（UB stalk）细胞RET活性较低。

• 此外，有假说提出RET通过空间限制性运动驱动尖端细胞发生流体化（tip fluidization by spatially restricted motility），这一过程涉及RET活性、MAPK通路及Spry1的调控关系，包括RET抑制（RET inhibition）和Spry1缺失（Spry1–/–）对RET活性的影响。

图4f（点击图片可放大）

• 通过光遗传学控制RET活性（optogenetic control of RET activity）的方案可用于解析细胞集体行为并控制分支形态发生（control over branching morphogenesis）。

• 该方案利用光照（hν）调控光遗传学修饰的输尿管芽细胞（optoRET UB），并通过调节光照时间频率（Temporal frequency）和暴露模式的空间比例/各向异性（spatial fraction/anisotropy of the exposed pattern）来控制光剂量。

• 以时间频率为纵坐标、暴露比例为横坐标，不同光照参数下可产生多种分支表型，包括无出芽（No budding）、出芽（Budding）、均匀生长（Uniform growth）和散射（Scattering）。

图4g（点击图片可放大）

• 通过工程化细胞间连接收缩力的各向异性（engineered anisotropy of cell–cell junction contractility），可以实现对细胞顶点操作（cell vertex operations）、细胞重排（cell intercalation）和上皮小管伸长（epithelial tubule elongation）的合成性控制。

• 这一合成性伸长（Synthetic elongation）策略利用各向异性基底/应力（Anisotropic substrate/stress），通过微管（Microtubule）和衔接蛋白（Adaptor protein）介导，并结合光遗传学RhoA招募（Optogenetic RhoA recruitment），实现垂直连接处的收缩（Contraction at vertical junctions），进而驱动细胞重排，最终对小管直径和长度进行调控（Tubule diameter/length control）。

图4h（点击图片可放大）

• 输尿管芽–肾单位融合（UB–nephron fusion）通过细胞身份与生物物理特性的趋同（convergence of cell identity and biophysical properties）实现。

• 当输尿管芽（UB）和远端肾单位（Distal nephron）的身份与生物物理特性相匹配时（Match identity/biophysical properties），二者能够发生混合（mixing）、吻合（anastomosis），并在两者之间形成连续管腔（formation of a continuous lumen between the two），最终建立输尿管芽–肾单位连接（UB–nephron connectivity）。

图5a（点击图片可放大）

• 与肾单位形成同步化的间质“传送带”（The stromal ‘conveyor belt’ synchronized with nephron formation）在肾源性生态位中与其他谱系发生相互作用。间质与肾发生之间存在协调关系（Stromal coordination with nephrogenesis），包括间质梯度（Stroma gradient）以及同步化的低表达与分化（Synchronized low and differentiation），涉及FOXD1阳性（FOXD1+）和FOXD1阴性（FOXD1-）间质细胞。

• 间质通过多种信号分子/转录因子（Stromal signals/TFs）作用于不同谱系：作用于肾单位祖细胞（NP）的包括FGF7、YAP/TAZ、FAT4、Decorin；作用于输尿管芽（UB）的包括维甲酸（RA）、肾素/血管紧张素（Renin/ANG）；作用于血管（Vasculature）的包括PBX1/PDGFRβ、Netrin、Ephrins、SDF1和SRF。

图5b（点击图片可放大）

• 在嵌合体类器官中引入间质祖细胞（SP cells）可促进高阶结构形成（higher-order structure formation）。

• 研究通过体外分化（In vitro differentiation）小鼠胚胎干细胞（Mouse ES cells），分别构建了不同组合的嵌合体类器官（Mosaic organoids）：一类仅含肾单位祖细胞（NP）和输尿管芽（UB），另一类同时包含肾单位祖细胞（NP）、输尿管芽（UB）和间质祖细胞（SP）。

• 结果显示，加入间质祖细胞后形成了具有更复杂结构的高阶类器官（Higher-order organoid）。

图5c（点击图片可放大）

• 用于引导血管化的微流控芯片（Microfluidic chip for guided vascularization）通过将类器官（Organoid）与促血管生成流动（proangiogenic flows）进行微流体整合（Microfluidic integration），实现血管连接（vascular connectivity）。

• 芯片中设有流动（Flow）通道，类器官包埋于细胞外基质（ECM）中，与宏血管（Macrovessel）和微血管（Microvessel）共培养（Culture），最终形成连通的血管网络。

图5d（点击图片可放大）

• 将体外发育工程（Dev. eng.）构建的工程化类器官（Engineered organoid）移植至肾包膜下（Subcapsular transplantation）是一种有效的体内成熟策略。

• 工程化类器官包含肾单位祖细胞（NP）和输尿管芽（UB），移植部位为成年小鼠肾脏（Adult mouse kidney）的肾包膜（Renal capsule）下。

• 在体内（In vivo）环境中，移植物能够实现宿主血管（Host vasculature）的长入整合（integration of host vasculature），并与宿主集合管（Host collecting duct）建立连接，最终完成血管化与成熟（Vascularization and maturation）。

发育工程学的未来发展需要同步深化对肾脏发育机制的理解，包括自我维持的输尿管芽尖端生态位、肾单位分段调控、分支终止信号及肾单位-输尿管芽吻合机制。

在这一过程中，整合间质、血管和神经结构将进一步提升组织成熟度与功能多样性。

同时，发育工程学可与分化方法改进相结合，包括增强肾单位祖细胞特化、多谱系组装、优化内皮分化等。

合成肾脏组织还可与可穿戴人工肾结合，拓展电解质平衡、血压调节、激素分泌等功能，并为患者来源iPS细胞的无动物疾病建模提供平台，尤其适用于先天性疾病研究。