研究内容

首先，研究者构建了一个用于促进肾脏类器官血管化的微流控培养平台。人诱导多能干细胞（hiPSC）分别被诱导分化为后肾间充质（MM）和输尿管芽（UB）祖细胞，并于分化第4天混合培养形成MM+UB肾脏类器官。同时，研究团队采用3D打印牺牲模板（3D Printed Sacrificial Template）技术制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片，在芯片内构建两条平行灌流通道及三个中央凝胶培养仓。分化第7天，将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种至灌流通道内以建立预血管化内皮层；分化第14天，将包埋于肾脏去细胞外基质（ddECM）水凝胶中的肾脏类器官置入中央培养仓，并在动态灌流条件下进行共培养，为后续血管样网络的形成提供实验平台（图1）。

在建立共培养体系后，研究者首先对培养条件进行优化。由于HUVEC与肾脏类器官对培养环境的需求不同，研究团队比较了EGM-2、Adv RPMI及两者1:1混合培养基对HUVEC状态的影响。结果显示，Adv RPMI组HUVEC的代谢活性与标准内皮细胞培养基EGM-2相当，且显著优于混合培养基组；同时，HUVEC在Adv RPMI中仍维持CD31阳性的内皮细胞表型。因此，研究者最终选择Adv RPMI作为后续共培养体系的统一培养基（图2）。

在确定培养基条件后，研究者进一步优化类器官的三维培养基质。通过比较ddECM和Geltrex两种水凝胶的培养效果发现，ddECM能够更好地维持类器官的三维结构以及LTL⁺近端肾小管和GATA3⁺远端肾小管/集合管样结构，而Geltrex组则出现明显的结构塌陷。进一步的基因表达分析显示，ddECM显著上调KRT8、VIM和VEGFA的表达，提示其不仅有助于维持肾脏组织特征，还能够增强类器官的促血管生成能力。因此，ddECM被确定为后续血管化培养的最佳基质材料（图3）。

在完成培养体系优化后，研究者开始评估该微流控平台促进血管化的能力。首先，HUVEC在灌流通道内形成连续的CD31⁺内皮层；随后，将ddECM包埋的肾脏类器官置入中央培养仓继续培养。共培养5天后，原本呈单层排列的HUVEC发生明显重塑，形成分支状毛细血管样网络，并向类器官外围及内部延伸。相比之下，缺乏类器官的对照组未观察到类似现象，说明肾脏类器官能够诱导内皮细胞发生血管样重构，从而促进体外血管化过程（图4）。

最后，研究者对血管化类器官进行进一步表征，以验证新生血管与肾单位结构之间的相互作用。免疫荧光结果显示，共培养至第19天时，三个培养仓中的类器官均保留了LTL⁺近端肾小管样结构和PODXL⁺肾小球样结构，同时形成大量CD31⁺毛细血管样网络。值得注意的是，这些新生血管不仅分布于类器官外围，还向内部延伸，并与肾小管及肾小球样区域形成紧密接触。上述结果表明，该3D打印微流控芯片平台能够有效促进肾脏类器官的早期血管化，并推动血管网络与肾单位结构的整合，为进一步提高类器官成熟度和功能化水平奠定了基础（图5）。