肾功能衰竭无论源于疾病还是药物毒性，都会对患者生活造成极大影响。为解决研究和治疗中的难题，科学家们不断探索体外肾脏模型。其中，人类诱导多能干细胞（iPSCs）衍生的肾类器官已展现出巨大潜力，它们能模拟肾脏的复杂结构和功能，用于药物毒性筛查、疾病建模乃至未来移植。然而，类器官在培养过程中会出现一个严重问题——非肾细胞“乱入”。其中就有软骨细胞的生成，它会破坏类器官结构，限制长期培养和应用。

近期，Maastricht 大学 LaPointe 团队在 npj Regenerative Medicine 发表的重要研究，为这一挑战找到了突破口：通过延长 FGF9 的处理时间，能够显著减少软骨细胞的形成，且不影响肾脏结构。

非靶向细胞的困扰

在 iPSC 衍生的肾类器官中，约有 10–20% 的细胞并非肾脏来源。这些非靶向细胞在培养第 18 天后逐渐出现，包括神经元、肌细胞和软骨细胞。甚至在类器官移植到小鼠肾包膜下后，软骨细胞仍能持续生长。研究显示，软骨的形成与 SOX9 和 COL2A1 等基因的上调密切相关，这些因子也是软骨分化的重要分子信号。软骨的大量出现不仅破坏肾脏结构，还限制了类器官在长期实验和临床应用中的价值。

图1. 肾类器官的分化培养流程及形态学与结构变化：研究采用iPSCs进行2D与3D诱导分化，经CHIR99021与FGF9/肝素处理后在气-液界面培养，类器官在7+18天时呈规则球形，具备肾小球、近端和远端小管、亨利袢及基质细胞等典型肾脏结构；至7+25天仍能检测到这些肾脏标志，但整体形态趋于不规则，并出现了缺乏肾脏标记的非靶向细胞群。

图2. 肾类器官长期培养过程中非肾细胞逐渐向软骨分化的趋势：在7+18天时，Alcian blue 染色未见软骨结构，而在7+25天时则观察到大量Alcian blue阳性区域，提示软骨的出现；这一结果在多株iPSC系类器官中均得到验证。与此一致，qPCR检测发现软骨相关基因 SOX9、COL2A1、ACAN、COL1A1、COL10A1 在7+25天显著上调；蛋白水平分析进一步证实 COL2A1蛋白的增加，而 SOX9 蛋白未见明显变化，整体说明软骨相关细胞群在长期培养中逐渐积累。

FGF9的改良作用

为解决这一难题，研究团队调整了经典的 Takasato 协议。在原始方案中，FGF9 的补充仅持续到第 7+5 天，而团队将其延长至第 7+12 天。实验结果显示：

• 显微观察：在第 25 天，常规培养的类器官中出现大量 Alcian blue 阳性的软骨，而 FGF9 处理组中几乎完全消失。

• 分子检测：FGF9 处理显著降低了软骨相关标志物 SOX9、COL2A1、ACAN、COL1A1、COL10A1 的 mRNA 和蛋白水平。

• 结构完整性：FGF9 改良组的类器官依然保留了关键的肾脏结构，包括肾小球、近端小管、远端小管和亨利袢。

这些结果表明，延长 FGF9 处理不仅能有效减少软骨生成，还能保持甚至改善肾脏结构的稳定性。

图3. 延长 FGF9 处理对肾类器官软骨形成的影响：研究在细胞聚集后将 FGF9 处理时间由第 7+5天延长至第7+12天（A），并在第7+25天进行检测。Alcian blue染色结果显示，对照类器官中可见大量软骨结构（B, C），而经过FGF9处理的类器官中这些软骨完全消失（D,E）。这一抑制软骨生成的效果在多株iPSC系中均得到重复验证。

图4. FGF9 处理对软骨相关分子表达的抑制作用：在第7+25天，FGF9处理的肾类器官中，软骨分化的五个标志基因SOX9、ACAN、COL2A1、COL1A1、COL10A1的mRNA表达水平相比对照组显著下降；同时，蛋白质水平检测显示SOX9与COL2A1在FGF9处理组均显著下调，定量分析进一步确认了两者的表达降低，表明FGF9能有效抑制肾类器官中软骨相关基因和蛋白的积累。

功能与优势的提升

除了减少非靶向细胞，FGF9 处理还带来了多方面的改善：

1. 血管化潜力增强：在第 25 天，FGF9 改良组中出现了类似血管的结构，并检测到 PECAM1/CD31 的上调。这意味着类器官具备更强的血管化能力。

2. 功能性蛋白表达上升：水通道蛋白 AQP2 在 FGF9 组显著增强，定位于小管内，显示类器官具备更复杂的水代谢能力。

3. 物质转运能力改善：通过牛血清白蛋白（BSA）摄取实验，研究发现 FGF9 改良组不仅保持了功能，还表现出更强的摄取能力。

4. 减少 EMT 表型：在常规培养中，类器官会随着时间发生 EMT，而 FGF9 处理有效抑制了这一过程，使类器官整体质量更高。

图5. FGF9处理不仅避免了非靶向细胞的出现，还维持并增强了肾类器官的肾脏结构与血管化特征：在第7+25天，免疫荧光结果显示FGF9处理的类器官仍保留典型的肾小球（NPHS1）、近端小管（LTL）、远端小管（ECAD）和亨利袢（SLC12A1）等标志，而对照组中这些结构部分缺失且伴随非肾细胞群。值得注意的是，FGF9处理恢复了亨利袢标志 SLC12A1的表达水平，使其接近第7+18天的状态。同时，甲苯胺蓝染色和免疫荧光显示FGF9处理组形成了血管样结构，并伴随内皮标志CD31/PECAM1的增强，提示该处理促进了肾类器官的血管化潜力。

图6. FGF9处理提升了肾类器官的功能特征：免疫荧光结果表明，FGF9处理组的通道蛋白 AQP2表达水平高于对照组，并定位于小管结构内；蛋白质检测进一步支持了这一发现。同时，BSA摄取实验结果显示，FGF9处理后的类器官在维持正常白蛋白摄取功能的基础上，其 BSA荧光信号显著增强，提示物质转运能力得到提升。

限制与展望

尽管 FGF9 改良大幅延缓了软骨的生成，但在第 32 天左右，仍能观察到少量软骨岛屿出现。这说明类器官的分化方法仍有待改进，本篇文章也是为未来的优化提供了坚实基础。研究团队指出，未来或许需要结合其他小分子或基质，进一步延长类器官的稳定期。此外，FGF9改良后的类器官是否能在体内移植环境中长期保持肾脏特性，还有待验证。

总结

这项研究展示了精细调控培养条件对类器官质量的深远影响。FGF9 的改良策略不仅提高了肾类器官的稳定性，也让它们更适合用于疾病建模、药物筛选。