肾脏近端小管是人体最重要的滤过和重吸收单元之一，负责回收约65%的肾单位滤液，包括葡萄糖、氨基酸和多种离子。但近端小管细胞高度易损，损伤常导致急性肾损伤、慢性进展，最终可能需要透析或肾移植。遗憾的是，目前关于近端小管发病机制的理解依然有限，缺乏合适的人类模型来研究这一关键细胞类型。

近年来，多能干细胞（PSCs）衍生的肾脏类器官成为研究肾脏发育与疾病的有力工具。然而，现有模型只能部分再现肾单位的发育谱系，未能生成成熟的近端小管细胞，导致在疾病建模和药物筛选中的应用存在重大限制。

本研究以此为切入点，提出通过调控肾单位前体细胞分化轨迹来推动近端小管的生成与成熟，从而突破类器官发育“停滞”的瓶颈。

一、研究思路：模拟体内发育轨迹，重塑近端分化

在体内肾脏发育过程中，近端前体细胞源自S型体阶段的特定细胞群，受Notch、Wnt、BMP、PI3K等多条信号通路协同调控。其中，转录因子HNF4A是近端发育的关键标志，决定了约300种溶质转运蛋白和代谢相关基因的表达。        

       然而，在现有类器官中，HNF4A的上调和近端分化过程并未顺利发生，导致细胞只停留在“类前体”状态，缺乏成熟功能。        

       研究团队假设，若能人为干预早期信号通路，可能重现体内的近端发育逻辑。于是，他们聚焦PI3K–Notch信号轴，尝试通过短暂抑制PI3K来触发Notch激活，从而推动肾单位朝近端方向分化。

二、关键发现：短暂PI3K抑制 → Notch激活 → 近端偏好

研究表明，在类器官早期（分化第10–12天）施加PI3K，能够显著上调Notch信号（包括JAG1、HES1等），并推动细胞从前体状态逐步转向HNF1B+/HNF4A+的近端谱系。        

       结果显示：        
1.  类器官中形成了更丰富、更广泛分布的近端前体群体；        
2.  HNF4A阳性细胞比例增加，出现了“近端偏好”肾单位；        
3.  这些细胞逐渐具备选择性转运白蛋白、葡萄糖等溶质的功能。

三、功能验证：类器官可模拟近端损伤反应

研究团队进一步在类器官中模拟肾毒性损伤（如顺铂处理）：        
-  近端偏好类器官出现小管结构塌陷、DNA损伤；        
-  损伤标志物HAVCR1/KIM1与SOX9上调；        
-  近端分化关键因子HNF4A下调。        

       这些反应与体内肾损伤高度一致，说明该类器官能够真实再现近端小管的损伤机制。

四、方法扩展：不同系统均可复现

研究不仅在iPSC衍生的类器官中实现了近端偏向，还在诱导肾前体细胞（iNPC）系统中得到了类似结果，表明该策略具有普适性。同时，实验验证了PI3K抑制与FGF9信号的区别，确认了PI3K–Notch通路的独特作用。

图1 研究团队通过对比人类胎儿肾脏与iPSC衍生肾脏类器官的免疫荧光染色，追踪了近端小管标志物 HNF4A 的出现时间和空间分布，发现类器官中HNF4A在第13–14 天才逐渐可见，延迟于体内。进一步，利用bulk RNA-seq和基因集富集分析表明，短暂的PI3K抑制（LY294002处理）会下调PI3K-Akt通路、上调Notch通路，从而驱动近端分化相关基因的表达。

图2：研究者利用单细胞转录组测序和免疫荧光对比了对照组与PI3K抑制处理组的肾脏类器官。分析显示，处理组细胞转录特征明显不同，富集于近端/管状谱系，伴随上调JAG1、HNF1B等近端相关基因，而对照组则更偏向足细胞等谱系。免疫荧光结果进一步验证，处理组中JAG1和HNF1B的表达增强，HNF4A 在此阶段尚未显著，但近端前体分化趋势已清晰。

图3：通过单细胞测序、bulk RNA-seq、免疫荧光和流式分析比较了对照组 与近端偏好（PI3K抑制）组类器官在第14–18天的差异。结果显示，近端偏好组细胞显著上调HNF4A及其他近端相关基因，且免疫荧光可见更早、更广泛的HNF4A⁺区域。HNF4A-YFP报告组流式分析证实处理组HNF4A⁺细胞比例增加。与人类胎儿肾脏的近端小管发育相比，处理组类器官更接近体内发育轨迹。定量分析表明，处理组的HNF4A⁺肾单位数量、面积和总面积均显著高于对照。

图4：研究通过单细胞转录组和免疫荧光动态追踪了对照组与近端偏好（PB）组 类器官在第10–21天的分化过程。结果显示，PB组从早期就持续增强HNF4A表达，并形成更长、更成熟的近端段，而对照组近端分化有限。HNF4A-YFP报告系的实时成像进一步证实，PB组在第15–18天出现更快、更明显的HNF4A信号。定量结果表明，PB组在不同时间点均有更多的近端标志物阳性结构，且片段长度更长。

图5：研究通过单核和单细胞转录组分析对比了近端偏好类器官在第21天与第27天的分化情况，并与既往报道的“近端增强”类器官进行整合分析。结果显示，PB 类器官在不同时间点均形成清晰的近端簇，表达多种有机离子/阴离子和药物转运体基因，与人类近端小管的分段特征高度吻合。跨数据集整合进一步表明，PB 类器官与既有的近端增强模型在基因表达谱上趋同，但保留部分独特特征。

图6：通过功能实验验证了近端偏好类器官的成熟度和对损伤的反应。实验证明，处理组类器官能同时摄取白蛋白（LRP2）和葡萄糖衍生物（Dextran），显示出功能性转运能力。顺铂损伤后，类器官表现出典型的近端小管损伤特征：HAVCR1表达升高，管腔连续性下降，出现DNA损伤标志（γH2AX上调），并伴随HNF4A下调和SOX9上调。随时间推移，损伤导致小管塌陷和细胞表型转变。

五、研究意义与展望

该研究不仅提出了一种新的类器官分化策略，还建立了一个可操作、可扩展的人类模型，为近端小管相关疾病（如急性肾损伤、近端小管病变等）的机制研究和药物筛选提供了前所未有的工具。更重要的是，它为未来临床转化应用打开了思路：通过优化类器官的细胞组成和成熟度，有望推动个体化肾病治疗和再生医学的发展。