近年来，肾类器官作为新兴工具，已成为模拟损伤修复过程的强大平台。然而，如何将肾类器官与其他细胞类型共培养以评估特定信号调控通路，仍需要更多创新的办法。而就在今年初，发表于《Journal of the American Society of Nephrology》上关于T调节细胞（Tregs）的研究给出了一个全新的思路。本研究独创了kidney organoids (KDOs)低氧共培养系统，结合转录组分析和小鼠缺血再灌注损伤（IRI）模型，揭示ST2+ Tregs通过分泌amphiregulin（AREG）保护肾前体细胞，为AKI免疫修复研究提供了宝贵范式。

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【脾脏Tregs转录组分析揭示ST2调控的独特基因签名】

为阐明ST2在Tregs中的基础调控机制，作者从脾脏分离ST2-high、ST2-low和ST2敲除（KO）Tregs，进行bulk RNA测序分析。这是因为脾脏Tregs代表稳态下的“原型”，能反映其在损伤前的特性。

结果显示，三组Tregs的基因表达呈现明显聚类差异：ST2-high和ST2-low更相似，而ST2 KO独立成簇。主成分分析（PCA）和欧氏距离聚类确认样本间差异稳定。差异表达分析揭示ST2-high vs ST2 KO上调基因包括修复因子AREG和GDF15，以及Treg功能相关基因如Ctla4、Il10、Tgfb1、Cd73、Tnfr2和Cd44；下调基因包括Cd39、Nrp1、Sell和Ghrl。其中，Areg在ST2-high Tregs表达最高，Gdf15在ST2-high和ST2-low相似但显著高于KO组。这表明ST2调控Tregs的增殖、免疫抑制和组织修复相关基因表达。

图1a：无监督聚类热图展示三组Tregs基因表达模式；图1b：PCA二维图分离样本组；图1c：样本间欧氏距离热图；图1d：火山图突出差异基因；图1e：选定Treg相关基因表达变化。（点击查看大图）

【GO和KEGG通路分析鉴定ST2调控的功能路径】

鉴于这些差异基因提示ST2影响Tregs的功能路径，作者进一步进行GO和KEGG通路分析，以识别潜在生物过程。这一步基于转录组数据，旨在连接基因表达与生理功能。

GO分析显示，ST2-high Tregs相对于KO组上调过程包括细胞周期正调控、细胞增殖、细胞因子介导信号和炎症响应；下调过程包括蛋白质泛素化、核质转运负调控和IFN-β产生。KEGG通路分析类似，上调路径涵盖EGFR、Jak-STAT、T细胞受体（TCR）、NF-κB和细胞周期；下调路径包括Fas信号、炎症小体和TLR信号。ST2-high vs ST2-low的比较进一步突出NF-κB上调和转录负调控下调。这些结果强化了ST2促进Tregs激活和修复功能的假设。

图2a：GO属性热图与上/下调条形图；图2b：KEGG路径热图与上/下调条形图。（点击查看大图）

【IRI模型验证Treg中ST2缺失加剧肾功能衰退】

基于转录组揭示的修复基因富集（如Areg），作者假设ST2缺失将削弱Tregs在肾损伤中的保护作用。为此，他们生成Treg特异性ST2敲除小鼠，并采用IRI模型验证体内效应。体外抑制实验首先确认ST2+ Tregs对T细胞增殖的抑制更有效。

双侧IRI模型显示24小时后肾功能损失相似，表明ST2在急性损伤抑制中非关键。但单侧IRI模型（14天后移除对侧肾）结果显示，敲除组血浆肌酐和血尿素氮（BUN）水平显著升高，提示ST2+ Tregs对损伤后期恢复至关重要。

图3a–b：脾Tregs流式分析确认敲除效率；图3c：体外抑制实验；图3d：单侧IRI实验流程；图3e–f：肌酐和BUN水平对比。（点击查看大图）

【组织学分析确认ST2缺失加剧肾损伤和纤维化】

为评估结构变化，作者进行组织学分析，以连接功能衰退与病理表现。这一步基于功能指标，旨在量化损伤程度。

结果显示敲除组肾小管坏死、铸型形成、扩张和间质白细胞浸润更严重，损伤评分更高。肾损伤标志物Kim1和Ngal mRNA表达上调。Masson三色染色量化显示敲除组纤维化面积增加，qPCR确认纤维化标志物Col1a1、Col3a1、Acta2（Sma）和Vimentin（Vim）表达升高。这证实ST2缺失加剧肾损伤和纤维化。

图4a–c：H&E染色图像；图4d：损伤评分；图4e：Kim1和Ngal表达；图4f–h：Masson染色图像；图4i：纤维化量化；图4j：qPCR热图。（点击查看大图）

【免疫细胞动态分析揭示ST2缺失的炎症机制】

因为观察到病理变化提示炎症加剧，作者进一步分析了免疫细胞动态，以探讨ST2缺失的免疫机制。这一步基于组织学结果，旨在揭示细胞水平变化。

流式细胞术显示IRI后Tregs在血液和肾脏增加、在脾脏减少；敲除组肾中性粒细胞浸润显著增多。脾CD4+ T细胞中IFNγ和TNFα产生增加，IL-10产生减少，IL-4无明显差异。免疫荧光证实敲除组肾间质中性粒细胞更多。这表明ST2+ Tregs通过抑制促炎响应维持肾稳态。

图5a：Tregs在血/脾/肾分布；图5b：肾中性粒细胞计数；图5c：脾CD4+细胞细胞因子产生。（点击查看大图）

【KDO共培养模型证实AREG依赖的保护机制】

体内结果暗示ST2+ Tregs可能通过分泌因子（如转录组中富集的AREG）发挥保护作用，但具体机制需体外验证。

为此，作者开发了一个独创的体外共培养系统，使用同系KDO和Tregs模拟低氧损伤环境。这项创新是论文的核心亮点，因为此前并无针对KDO与Tregs的标准化共培养协议，作者通过系统优化填补了这一空白。该模型的重要性在于，它直接桥接了体内观察与细胞水平机制，证明了ST2+ Tregs在肾修复中的关键作用，为未来药物筛选和免疫疗法提供了可靠的体外平台。

首先，作者从C57BL/6J小鼠胚胎干细胞生成KDO，通过优化分化协议，确保KDO表达肾标志如Nephrin、Pax8、Sox9和Lgr5，并具备初期肾结构特征。

其次，他们测试多种培养介质（如RPMI、EB Basal和α-MEM），发现α-MEM（补充核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、L-谷氨酰胺和10% FBS）在维持KDO和Tregs活力方面最佳（图6a）。

然后，使用0.4μm Trans-well系统分离细胞：上室放置约10^5个从脾脏分离的Tregs，下室放置约50个KDO，避免直接接触但允许分泌物交换（图6b i）。为模拟IRI下的低氧损伤，他们将系统置于密封低氧室（1% O2、5% CO2、氮气平衡，37°C），维持6小时低氧后，切换到正常氧（20% O2）再氧合1小时。KDO活力评估结果显示低氧导致活力显著下降，但与ST2+ Tregs共培养可保护活力，而ST2 KO Tregs无效（图6b ii）。

进一步，作者收集Tregs的过滤上清（FSM），ELISA检测显示野生型FSM中AREG水平更高（约40 pg/ml）；使用ST2 KO FSM时活力未恢复，但补充重组AREG后恢复正常，证实AREG依赖机制（图6c）。这一独创模型不仅验证了分泌物的关键作用，还突出了其在肾损伤研究中的潜力。

图6a：培养介质优化对比；图6b：Trans-well系统示意图及活力评估；图6c：FSM中AREG水平、补充AREG的活力恢复。（点击查看大图）

【AREG敲除模型验证其在体内的必要性】

为确认AREG在体内的必要性，作者生成Treg特异性AREG敲除小鼠，并重复IRI实验，以验证其对肾损伤的贡献。这一步基于KDO结果，旨在桥接体外机制与体内效应。

敲除组显示血浆肌酐、BUN和损伤评分升高，组织学损伤更严重。qPCR显示Kim1、Ngal和纤维化标志物上调。Tregs在血液、脾脏和肾脏数量减少；脾CD4+ T细胞中TNFα产生增加，IL-10和IL-4产生减少，IFNγ略升。这与ST2缺失现象相似，强调AREG在Treg稳态和保护中的核心作用。

图7a–b：肌酐和BUN；图7c–d：损伤评分和H&E图像；图7e：qPCR热图；图7f：Tregs分布；图7g：细胞因子产生。（点击查看大图）

【单细胞RNA测序确认肾特异性ST2+ Tregs修复机制】

鉴于脾转录组代表稳态，为探讨肾损伤后Tregs的特异变化，作者从IRI肾脏分离CD4+ T细胞，进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。这一步基于整体结果，旨在确认肾特异性机制。

UMAP显示野生型（WT）和敲除组（KO）聚类不同；Tregs中Foxp3、Areg和Il1rl1共表达，并在WT更高。Il1rl1+子集更激活，与KO分离；KEGG分析显示上调路径包括细胞周期、mTOR、AMPK和TCR。这确认肾ST2+ Tregs在损伤环境中具有增强的修复功能，与脾结果一致。

图8a–b：UMAP聚类；图8c：基因共表达；图8d–f：子集分析；图8g–h：KEGG富集。（点击查看大图）

• 1. IL-33/ST2通路与肾脏损伤：研究重点关注IL-33/ST2信号通路如何通过Tregs调节肾脏的炎症和纤维化。

• 2. ST2缺失的影响：在IRI模型中，Tregs中特异性缺失ST2或AREG的小鼠表现出更严重的肾脏损伤、炎症和纤维化，表明ST2表达的Tregs在保护肾脏功能和减轻纤维化方面起着重要作用。

• 3. 肾脏类器官的共培养研究：研究采用了新型的共培养系统，将肾脏类器官（KDOs）与Tregs在低氧条件下共培养。ST2缺失的Tregs未能保护KDOs免受低氧损伤，而野生型Tregs能够保护，强调了ST2表达的Tregs在肾脏修复中的保护作用。

本文展示了一种肾类器官共培养系统在AKI修复机制研究中的新路径。研究团队通过转录组分析和IRI模型，结合KDO低氧共培养，揭示IL-33/ST2通路调控Tregs产生AREG，促进肾损伤修复。该研究构建了“转录组发现—体内验证—体外机制”的闭环流程，显著提升了免疫调控评估能力。

对于肾类器官而言，该模型的创新在于模拟前体细胞低氧脆弱性，并直接验证Tregs分泌物作用。肾类器官在实际应用中存在一定门槛，如高成本或操作难度大等问题，但随着近十年的发展，肾类器官培养和实验操作已经逐渐趋于系统和标准化。比如本研究中的KDO基于标准胚胎干细胞的分化方法，经过实际操作证明，其成本可控且低于动物模型，而且通过标准优化实验协议，操作难度也可以大大降低。关键在于，研究者需要根据实验需求尝试这一新型研究工具，就能发现其潜力。像华津生物这样的类器官技术平台，能够为研究者提供全方位的技术支持和产品服务，帮助大家更轻松地将KDO整合到实验中。

文章来源：Sabapathy, V. et al. ST2+ T-Regulatory Cells in Renal Inflammation and Fibrosis after Ischemic Kidney Injury. J. Am. Soc. Nephrol. 2025, 36, 73–86.