肾脏发育的核心在于肾祖细胞（Nephron Progenitor Cells, NPCs），它们负责生成肾小球、肾小管等功能单元。传统研究依赖于胚胎分离或干细胞诱导，但受限于短期培养、异质性和基因编辑难度，难以实现大规模疾病建模或药物筛选。近年来，肾类器官技术快速发展，三维肾类器官已成为模拟肾发育、遗传性肾病（如多囊肾病）和药物毒性的理想平台。然而，如何实现NPC的长期扩增、提升类器官成熟度，并揭示肾细胞塑性，依旧是挑战。

USC的李中伟团队在2024年开发了一种化学定义的2D培养系统，支持小鼠和人类NPC的克隆扩增，并应用于肾类器官成熟、CRISPR筛选、细胞塑性和ADPKD建模。该系统不仅生成更成熟的足细胞，还揭示了足细胞向NPC的重编程潜力，并通过基因编辑NPC快速筛选多囊肾抑制剂。这一工作为肾类器官智能化与精准医学结合提供了范式，发表于《Cell Stem Cell》，标志着肾再生研究的重要突破。

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【p38抑制实现任意小鼠品系NPC系的衍生与扩增】

本研究首先优化了小鼠NPC（mNPC）培养介质mNPSR-v2，通过添加p38抑制剂SB202190、Notch抑制剂DAPT、TGF-β抑制剂A83-01和BMP抑制剂LDN193189，并调整CHIR99021浓度，支持mNPC的长期2D克隆扩增（图1A）。实验显示，SB202190对维持SIX2+/PAX2+细胞比例至关重要（图1B），而体内自续mNPC的p38活性本就较低（图1C）。培养的mNPC形态均匀（图1D）、稳定增殖（图1E），并均匀表达NPC标志物如SIX2、PAX2、SALL1、WT1和ITGA8（图1F–G）。体外诱导实验中，mNPC与脊髓共培养形成肾小管样结构（图1H），并分化为PODXL+肾小球、LTL+近曲小管和CDH1+远曲小管（图1I）。克隆效率高达60%–70%（图1J–N），RNA-seq PCA显示培养mNPC与E11.5–E13.5原代NPC高度相似（图1O–P）。该系统适用于任意小鼠品系，包括E11.5元肾间充质或全肾细胞衍生。

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图1A：mNPC衍生与应用示意图；图1B：不同条件下SIX2+/PAX2+细胞比例量化；图1C：E13.5肾切片p38活性免疫染色；图1D–E：mNPC形态与生长曲线；图1F–G：标志物免疫荧光与量化；图1H–I：脊髓诱导形成的肾结构亮场与免疫荧光；图1J–N：单细胞克隆扩增、生长曲线、克隆效率与类器官免疫荧光；图1O–P：RNA-seq PCA与标志物热图。

【mNPSR-v2揭示发育中小鼠肾细胞的塑性】

在成功建立小鼠NPC的长期扩增系统后，研究团队注意到培养过程中一些非NPC细胞表现出意想不到的表型转化，这提示了潜在的细胞塑性机制。为了深入探讨这一现象，他们利用该系统进一步考察了发育中小鼠肾细胞在mNPSR-v2介质中的行为变化。

研究观察到mNPSR-v2可诱导非NPC细胞（如Six2-GFP–细胞）转化为SIX2+/SALL1+表型（图2A–B）。从P3–P7肾细胞培养中，约17% P3细胞在4天内诱导为SIX2+/SALL1+（图2C–D），效率在mNPSR-v2中最高（18%）。使用Six2-tdT谱系示踪，诱导细胞表达完整NPC基因谱（Six2、Pax2等），丢失肾标志物（Slc12a1等）（图2E–F）。进一步，Wnt4+细胞（NPC直接后代）在mNPSR-v2中高效逆转为SIX2+/SALL1+（>70%）（图2G–J），表明mNPSR-v2模拟了体内NPC龛，支持Wnt4+细胞的塑性逆转。

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图2A–D：Six2-GFP–和新生肾细胞诱导的免疫荧光与量化；图2E–F：Six2-tdT诱导示意图、FACS与qPCR；图2G–J：Wnt4-tdT示踪示意图、FACS、免疫荧光与量化。

【全基因组CRISPR筛选提供肾发育与疾病资源】

基于mNPSR-v2系统对小鼠NPC的稳定支持和塑性揭示，研究者认识到这一平台适合进行大规模基因功能分析。为了从全基因组层面理解NPC自续和相关疾病机制，他们引入CRISPR敲除文库进行筛选实验。

引入全基因组CRISPR敲除文库到mNPC中，筛选自续相关基因（图3A）。Beta分数分析显示负选择“泛必需基因”（图3B–C），IPA富集mTOR、miRNA生物合成和氧化磷酸化路径（图3D）。FGF、WNT和LIF信号基因被负选择（图3E）。筛选出64个潜在NPC自续基因，25个核定位，包括Sall1、Wt1等（图3F）。11/30 Wilms瘤基因和25/330 CAKUT基因被鉴定（图3G–H）。验证Kmt2a和Kat6a为必需（图3I–M），抑制剂处理降低NPC标志物表达。

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图3A：CRISPR筛选流程；图3B–C：Beta分数分布与共同基因散点图；图3D：IPA路径富集；图3E–I：信号路径散点图与sgRNA计数；图3J–M：抑制剂免疫荧光与量化。

【YAP激活衍生长期可扩增人类NPC系】

CRISPR筛选结果强调了信号通路在NPC维持中的作用，这启发研究者将小鼠系统的优化经验扩展到人类NPC，以实现更贴近临床的应用。为此，他们调整介质成分，开发支持人类诱导NPC（iNPC）的长期扩增系统。

原代hNPC中p38、TGF-β和BMP活性低（图4A–C）。hNPSR-v1支持短期iNPC扩增，但YAP核表达丢失（图4D–E）。添加YAP激动剂TRULI制成hNPSR-v2，支持>3个月稳定扩增（图4F–H），>95%细胞表达SIX2/PAX2等（图4I–J）。克隆效率58%–70%（图4K–L）。RNA-seq显示v2培养iNPC更似原代NPC（图4M–O）。支持基因编辑（图4P–Q）。诱导形成无脱靶细胞的肾类器官，包括成熟PODXL+/NPHS1+肾小球、LTL+近曲小管和SLC12A1+亨勒环（图4R–U）。

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图4A–C：人胎肾切片免疫荧光；图4D–E：YAP表达变化；图4F：iNPC衍生示意图；图4G–H：形态与生长曲线；图4I–J：标志物免疫荧光与量化；图4K–L：克隆扩增图像；图4M–O：RNA-seq PCA与热图；图4P–Q：基因编辑图像与量化；图4R–U：类器官免疫荧光。

【单细胞多组学揭示iNPC类器官的体内样肾生成与成熟足细胞】

在确认hNPSR-v2能生成高质量iNPC后，研究团队进一步评估这些iNPC诱导的肾类器官的成熟度和细胞组成，以验证系统是否能产生更接近体内肾生成的结构。

时间序列RNA-seq显示从NPC到成熟肾的渐进变化，早足细胞基因在day7–10、晚足细胞基因（如COL4A3/4）在day10–21上调（图5A–C）。snRNA/snATAC-seq鉴定足细胞、近/远曲小管、间质和少量脱靶细胞（0.67%）（图5D–F）。整合其他数据集显示iNPC类器官足细胞比例更高、脱靶更少、无残留NPC（图5G–H）。足细胞表达更高晚期基因，ATAC-seq开放染色质似成人肾（图5I–N）。

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图5A：实验设计；图5B–C：PCA与热图；图5D–F：UMAP、签名基因与点图；图5G–H：整合UMAP与细胞比例；图5I–N：标志物点图与基因组浏览器视图。

【hNPSR-v2揭示人类足细胞塑性】

鉴于iNPC类器官显示出更高的成熟度，研究者借鉴小鼠系统的塑性发现，考察hNPSR-v2是否也能诱导人类肾细胞的逆编程，以揭示人类足细胞的潜在可塑性。

从SIX2-GFP–非NPC诱导rNPC，27.7%转为SIX2-GFP+（图6A–C）。RNA-seq显示与iNPC相似（图6D）。PODXL+/SIX2–足细胞在hNPSR-v2中44.6%转为rNPC（图6E–J）。MAFB-GFP+足细胞类似重编程（图6K–O）。原代足细胞也衍生rNPC（图6P–R）。时间序列RNA-seq显示经PTA/RV中间态逆转（图6S–T）。

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图6A–D：重编程示意图、FACS、形态与PCA；图6E–J：足细胞FACS、形态与免疫荧光；图6K–O：MAFB-GFP类器官、FACS、形态与免疫荧光；图6P–R：原代足细胞FACS与类器官；图6S–T：热图与模型。

【基因编辑NPC的快速PKD建模与小分子筛选】

利用该系统的基因编辑兼容性，研究团队将目光转向实际疾病应用，通过敲除PKD基因在NPC中建模ADPKD，并进行小分子筛选，以展示平台的药物发现潜力。

Pkd1/2敲除mNPC诱导囊肿类器官，抑制剂如CFTRinh172降低囊肿（图7A、C–F）。snRNA-seq显示增殖、mTOR/MYC激活和代谢上调（图7E）。筛选148个化合物鉴定HDAC、BRD4和BMI-1抑制剂（图7G–H）。人PKD2–/–iNPC类似建模，PTC-209剂量依赖抑制囊肿（图7I–N）。

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图7A–B：建模示意图；图7C：聚集与囊肿亮场；图7D–F：增殖免疫荧光、热图与代谢曲线；图7G–H：筛选热图与命中；图7I–N：PKD2编辑、囊肿图像与抑制量化。

这篇发表于《Cell Stem Cell》的论文（Huang et al., 2024）开发了一种化学定义的二维（2D）培养系统（mNPSR-v2和hNPSR-v2），成功实现了小鼠和人类诱导的肾祖细胞（NPCs）的长期克隆扩展。该系统通过调控p38 MAPK和YAP信号通路，不仅支持从多株小鼠和人类多能干细胞（hPSCs）来源的NPCs稳定扩增，还生成肾单位器官（nephron organoids），这些器官中足细胞（podocytes）表现出更高的成熟度，表达关键基底膜成分如COL4A3和COL4A4——这在以往体外肾小器官中仅见于移植到小鼠肾脏后的模型。此外，论文揭示了人类足细胞的惊人塑性：它们可在hNPSR-v2介质中逆转分化，重编程回NPC-like状态，支持肾发育的动态可塑性研究。同时，通过全基因组CRISPR筛查，作者鉴定出调控肾发育、Wilms肿瘤和先天性肾尿道异常（CAKUT）的关键基因，并利用基因编辑NPCs快速建模常染色体显性多囊肾病（ADPKD），并筛选出新型小分子抑制剂。

论文讨论部分强调，该系统将促进对p38 MAPK和YAP在NPC扩展中机制的深入研究，并探索足细胞塑性的分子基础。展望未来，该平台有望优化肾小器官生成全谱肾单位（如Henle环和远端小管），通过筛选条件最大化iNPCs发育潜力。相比传统hPSC系统，其纯净、可操控的NPC基础更适合高通量药物筛查和个性化医学。例如，在遗传性肾病（如Alport综合征）建模中，可利用重编程足细胞开发精准疗法；在再生医学中，扩展NPCs可推动肾组织工程和移植。总体而言，这项工作标志着肾发育研究进入“可扩展、可编辑”时代，将加速从基础洞见到临床转化的进程，为肾病患者带来新希望。期待后续研究扩展到成人肾祖细胞或多器官交互模型，进一步桥接体外与体内差距！

文章来源：Huang et al., 2024, Cell Stem Cell 31, 921–939. doi:10.1016/j.stem.2024.04.002